肠道上皮依赖肠道干细胞（Intestinal Stem Cell，ISC）维持组织稳态、修复损伤并适应环境挑战^[1]。ISC异常增殖可驱动结直肠癌发生，而ISC耗竭则与溃疡性结肠炎、放射性肠病及年龄相关的上皮退化密切相关。尽管其临床意义重大，但ISC如何在肠道发育过程中被选择出来，并实现规律的空间排布？目前人们对ISC的选择机制还知之甚少。

在经典模式生物果蝇的肠道发育过程中，幼虫肠道AMP（Adult Midgut Progenitor Cell）细胞增殖形成AMP岛^[2]。既往假说认为每个AMP岛会“选出”一个细胞成为未来的ISC^[3]。然而，这一理论还未被实验所证明。而在哺乳动物小鼠模型中，尽管已有研究表明胚胎期E13.5阶段的ISC选择与Wnt信号通路激活密切相关^[4]，但ISC如何实现间隔性选择仍需进一步探究。

2025年12月3日，华中科技大学同济医学院郭峥教授课题组与华中科技大学同济医学院附属协和医院蔺蓉教授课题组合作在Science Advances杂志在线发表了题为Drosophila and mouse intestinal stem cells are spatio-temporally specified by Notch suppression and Wnt activation的研究论文。该研究阐明了ISC命运选择的核心机制：Wnt与Notch信号通路的时空协同作用实现了ISC的命运决定：Wnt激活区域划定了选择范围，而范围内的上皮细胞通过Notch信号通路进行命运选择。

该团队发现果蝇ISC在蛹形成后（After puparium formation，APF）的8小时到12.5小时内被选择出来。在这有限的时间窗口，从约900个AMP岛（约6000个AMP细胞）中，“稀疏”选择出大约150个ISC，随后ISC通过对称分裂扩大ISC池，至43h APF，产生了约600个ISC。推翻了前人“一AMP岛，一ISC”的经典假说。

图1 ISC的命运选择轨迹和命运选择过程中主要通路变化

A.t-SNE 可视化图显示基于标记基因表达对各细胞类型进行着色。样本量为 5384 个细胞核。B.中肠上皮细胞的拟时序轨迹分析：按注释细胞类型着色的发育轨迹，箭头表示细胞命运选择的方向。C.ISC-p1/p2命运标记的基因表达热图和按照拟时序顺序聚类的ISC分支的3个信号模块。中间代表AMP开始分化的伪时间。

通过对果蝇蛹期8-12小时APF的肠道进行单细胞核测序分析，该团队首次绘制了肠道发育早期上皮不同细胞命运选择的轨迹图（图1.A和B）。结果提示ISC命运选择可能与Notch、Wnt、EGFR信号通路相关（图1.C）。接下来，研究团队通过一系列细胞生物学、遗传学和谱系追踪实验证实：ISC的选择必须同时满足两个条件，即Notch信号通路的抑制与Wnt信号通路的激活。当同时敲除Notch信号通路并激活Wnt信号通路后，所有AMP均被选择成为了GFP+ 的ISC（图2. A）。此外，在哺乳动物中，隐窝Lgr5+ ISC中的APC突变会持续激活Wnt信号通路，导致肠道未分化肿瘤的产生[5]。该团队在果蝇ISC命运选择过程中突变APC，同样产生了高增殖，低分化的肿瘤样细胞团，对应了在哺乳动物肠隐窝中观察到的肿瘤发生情况（图2.B）。该团队发现EGFR信号通路影响ISC的增殖，但并不参与ISC的选择过程。

图2 ISC的命运选择及在命运选择时诱导Apc突变会产生未分化肿瘤

A.在12.5h APF 时，对照组（esgts>GFP）和 esgts>NotchRNAi+armΔN 中 ISC（esg>GFP）的代表性图像。B.Apc1^Q8Apc2^19.3MARCM克隆的代表性图像，在幼虫 EL3 阶段开始诱导克隆，在出蛹后14天检测。

那么，Wnt和Notch信号通路是如何协同作用，实现约1/40的ISC选择概率？该团队揭示，来源于肠道中部的环形肌肉，与meconium（由幼虫中肠肠细胞包裹幼虫食物所形成）两端分泌的Wg为ISC的选择提供了“前-中-后”特定空间分布的Wnt信号激活区域（图3.A）。在这些Wnt激活区域中，Notch信号介导的侧向抑制仅在相邻细胞中选择出一个AMP成为ISC。通过这种时空配合的选择机制，保证了肠道中稀疏选择出固定数目的ISC及其相对固定的ISC选择位置（图3.B）。

图3 Notch和Wnt信号决定肠道ISC的数目和空间位置

A.12.5h APF时，肠道中wg>GFP表达的代表图像。上图：包含胎粪的中肠。下图：分离出来的胎粪。B.肠道ISC命运选择的模型：（上图）肌肉和胎粪中的Wg分泌建立了ISC选择的区域。Notch信号在这些区域内介导侧向抑制，以完善ISC的命运选择。（下图）野生型、Wnt过表达和Notch抑制条件下的ISC分布模式。

在小鼠胚胎肠道发育过程中，Wnt信号激活促进Lgr5+ ISC的选择[4]。鉴于在果蝇肠道中抑制Notch信号通路促进了ISC的选择，该团队进一步探索了在小鼠胚胎肠道发育中抑制Notch信号通路对Lgr5+ ISC选择的影响。实验表明，在胚胎第9.5天（E9.5）抑制Notch信号通路后，至E12.5时，绝大多数的肠道上皮均被选择为Lgr5+ ISC。证明小鼠Lgr5+ ISC的选择同样需要抑制Notch信号通路（图4.A）。在胚胎ISC选择完成后的E16.5抑制ISC中Notch信号通路，导致新生小鼠肠道中 Lgr5-EGFP+ISC细胞显著减少，同时杯状细胞数目增加（图4.B），这说明在ISC确立之后，Notch信号的作用发生了转变：从早期限制ISC命运，转为维持ISC干性、阻止其分化为分泌型细胞。

图4 胚胎发育过程中，Notch 抑制有助于ISC选择，但随后导致其分化

A.纵切面显示E10.5至E12.5期间对照组和DAPT处理小鼠E13.5肠道的Lgr5-EGFP⁺ 染色情况。B.E16.5至E18.5期间对照组和DAPT治疗组小鼠P0小肠中Lgr5-EGFP⁺ 和杯状细胞的Muc2染色。

综上所述，该团队的研究揭示，在时空精准配合下，通过“抑制Notch、激活Wn”这一组合信号，可在肠道发育过程中稀疏选择ISC，且该机制从昆虫到哺乳动物高度保守。这提示了果蝇蛹期中肠发育过程与哺乳动物隐窝基部更为相似，两者在ISC命运决定阶段均依赖Wnt与Notch信号的协同作用，随后均需要Notch信号维持ISC干性。而果蝇成虫肠道上皮的稳态维持则类似于哺乳动物小肠的TA区和其产生的绒毛区域，其主要依赖Notch信号驱动细胞分化，较少需要Wnt信号的参与。这种时空上的对应关系表明，果蝇蛹期中肠可以作为研究哺乳动物小肠隐窝中ISC增殖和表皮稳态维持的保守模型。该研究所揭示的Notch信号通路在ISC选择和维持过程中所具有的截然相反功能，以及Wnt信号在ISC选择过程中所扮演角色，为探索癌症发生提供了新的研究视角。

华中科技大学同济医学院基础医学院医学遗传系郭峥教授和华中科技大学同济医学院附属协和医院蔺蓉教授为本研究论文的共同通讯作者。华中科技大学同济医学院博士生吴悠为该论文第一作者。

原文链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/41337595

[1]       Beumer J, Clevers H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine [J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2021, 22(1): 39-53.

[2]       Jiang H, Edgar B A. EGFR signaling regulates the proliferation of Drosophila adult midgut progenitors [J]. Development, 2009, 136(3): 483-93.

[3]       Mathur D, Bost A, Driver I, et al. A transient niche regulates the specification of Drosophila intestinal stem cells [J]. Science, 2010, 327(5962): 210-3.

[4]       Nigmatullina L, Norkin M, Dzama M M, et al. Id2 controls specification of Lgr5(+) intestinal stem cell progenitors during gut development [J]. Embo j, 2017, 36(7): 869-85.

[5]       Barker N, Ridgway R A, van Es J H, et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer [J]. Nature, 2009, 457(7229): 608-11.